生化测定结果的可靠性、真实性和可用性

发布日期：2022-05-26 12:54 浏览次数： 作者：admin

       生化测定的目的是解明某种生物学现象产生的代谢机制，为进一步通过分子生物学和细胞生物学等手段，研究该生物学现象的调控机制提供线索。
       为实现上述目的，就需要确保生化测定结果的可靠性、真实性和可用性。
1. 生化测定结果的可靠性
       生化测定结果的可靠性是指生化测定结果能够可靠地反映某种生物学现象与某个代谢的联系。
       生化测定结果的可靠性取决于生物样本的典型性、代表性和重复性，以及测定指标的合理性。
1.1 生物样本的典型性
       生物样本的典型性是指与对照组相比，处理组能够稳定地出现某种生物学现象。
       如果处理组和对照组在某种生物学现象上不存在显著差异，那么就不应该进一步进行生化测定，否则容易得出错误结论。
       假如某个代谢确实与该生物学现象相关，由于处理组与对照组在该生物学现象上不存在显著差异，则生化测定结果必然也不存在显著差异，从而得出某个代谢与该生物学现象无关的错误结论。
       相反，假如某个代谢确实与该生物学现象无关，由于处理组与对照组在该生物学现象上不存在显著差异，则生化测定结果在处理组和对照组之间可能不存在显著差异，也可能存在显著差异。如果生化测定结果存在显著差异，那么就会得出错误结论，误认为该种生物学现象与这个代谢的变化有关！
       取样缺乏典型性，是导致生化测定结果可靠性差的首要原因。
1.2 生物样本的代表性
       生物样本的代表性是指所取样本能否代表本组（处理组内或者对照组内）的整体状态。
通常难以严格控制全部环境条件，因此同一组内不同个体的生长发育总是存在一些差异。所取样本应该从该组内大多数个体中选取，即排除生长发育最好和最差的两部分个体。
       一般来说，实验室中培养的生物，其生长发育的差异要显著小于大田培养的生物，野外生物的生长发育差异最大。
       如果取样缺乏代表性，那么生化测定结果也就缺乏代表性，不能代表处理组或者对照组的整体状态。
       取样缺乏代表性是导致生化测定结果可靠性差的第二个原因。
1.3 生物样本的重复性
       为了排除随机因素的影响，从统计学的角度要求设置重复样本。
       生物样本的重复性是指在某一个取样时间点，所取重复样本（所取的某个组内的三个以上样本）相互之间差异的大小。
       重复样本之间差异越大，则生化测定结果的差异就越大，即重复性越差。
       生物样本的重复性和测定本身的重复性两者共同决定了生化测定结果的重复性。
       取样缺乏重复性是导致生化测定结果可靠性差的第三个因素。
       此外，在保存过程中生物样本发生变质，或者拟测定指标，如易氧化的物质或者易失活的酶类，发生了显著变化，也是导致生化测定结果可靠性差，甚至测定失败的重要原因。
2. 生化测定结果的真实性
       生化测定结果的真实性是指生化测定结果反映了所测定生物样本中所测定指标的真实情况。
       生化测定结果的真实性取决于测定方法、测定用品和测定操作。
2.1 测定方法的专一性、重复性和简便性
       研究者一般根据测定指标、生物样本特点和所具备的测定条件，选择适合的测定方法。
       但是，就测定方法本身来说，应该依次按照检测对象的专一性、测定结果的重复性和测定操作的简便性来比较同一指标的不同测定方法。检测对象不专一，测定结果无效；测定结果重复性差，测定结果不能用；测定操作不简便，步骤越多，误差就越大，而且测定成本（费用、时间和精力等）也就越高。
       测定方法的专一性、重复性和简便性不好是导致生化测定结果真实性差的首要因素！
2.2 测定用品的质量和性能
       工欲善其事必先利其器。测定用品包括仪器设备、试剂和耗材。
       举个例子：与分光光度计相比，酶标仪具备两个优势：（1）测定效率高，一次可以扫描整块酶标板；（2）测定结果重复性好，可以自动振荡混匀反应体系和控制反应温度。
       测定用品的质量和性能不好是生化测定结果真实性差的重要因素。
2.3 测定操作规范和到位
       测定操作规范是指测定人员严格按照说明书操作仪器设备、配制各种试剂和测定各步骤。
       测定操作不规范是导致测定不能顺利进行，甚至彻底失败的主要原因之一。例如，酶标仪不预热，冷冻离心机不预冷，临用前配制试剂配制过早或者使用时间过长，漏加试剂等。
       测定操作到位是指该步操作确实达到了目的。
       测定操作不到位是导致测定结果不真实，如数据变化不规律，重复性差的主要原因之一。例如，哺乳动物酶活性测定一般要求在37^oC中进行。但是，测定人员在酶标仪上设定了37^oC，但是没有把试剂，尤其是占体积比例最大的缓冲液，预热到37^oC；而是从冰箱里取出后直接加大酶标板的反应孔里。一般酶活性测定也就反应90秒，这样的话，从反应开始到反应结束，即测定过程中反应体系的实际温度远远低于37^oC。按照化学反应的温度系数（Q₁₀），酶活性测定结果就会严重偏低，甚至接近于零，这样的测定结果当然不真实，导致得出错误结论。
       测定操作不规范和不到位是导致生化测定失败，或者生化测定结果不真实，偏高或者偏低，重复性差，数据变化不规律的最常见原因！
3. 生化测定结果的可用性
       除了上述生化测定结果的可靠性和真实性外，还要注意生化测定结果的可用性。
       生化测定结果的可用性依次指（1）生化测定数据本身的好坏，（2）根据这些生化测定数据，能否得出明确、可靠的研究结论，（3）这些生化测定数据能否支撑起一篇高水平的研究论文。
3.1 生化测定数据本身的好坏
       评价生化测定数据本身的好坏，主要看其（1）变异系数（标准误/平均值）大小，即重复性；（2）平均值的变化范围，是否严重偏离文献报道值；（3）变化趋势，即组内数据变化是否有规律；（4）组内和组间是否存在显著差异，尤其是处理组与对照组差异是否显著。
       如上所述，生化测定数据的变异系数取决于生物样本的重复性和测定本身的技术重复性。必须指出的是，并不是变异系数越小越好。如果变异系数太小，可能会导致错误结论，即本来差异不显著，却判断为显著，而且往往会引起审稿人的怀疑。 如果变异系数确实比较大，那么可以检查一下技术重复性和生物样本重复性，如果技术重复性还好，而是生物样本重复性差，那么增加测定重复次数，例如从3次增加为5次，就可以把变异系数降为原来的一半。也可以尝试做一下差异显著性检验，或许检验结果是差异显著呢。
       如果测定的平均值严重偏高或者偏低，那么就容易引起审稿人的怀疑。此时需要（1）细查测定和计算情况，是否存在错误；（2）核对文献报道中所采用的测定方法、生物样本和计算单位（尤其是干重还是鲜重）是否具有可比性；（3）文献的权威性，如各种国家或者行业标准的权威性就显著高于研究论文，权威期刊的可信度就高于普通期刊，大多数研究论文就高于个别研究论文等；（4）物种的内稳态情况，例如哺乳动物的血糖浓度变化范围就显著小于昆虫等。当然，如果确实偏离比较严重，就需要查找真正的原因，否则只能放弃这批数据。
       如果组内测定数据变化无规律，通常是由于取样或者测定本身造成的，例如取样缺乏典型性和代表性，测定时匀浆提取程度不一致，或者计算时作为分母的指标本身变化不规律，当然也可能是该代谢与所研究的生物学现象无关。
       如果上述变异系数、偏离程度和变化规律三个方面都没有问题，那么组内和组间差异是否显著，这个是不能强求的。可能情况包括（1）如果该代谢的测定指标都没有显著差异，那么所研究生物学现象确实与这个代谢无关，（2）所研究生物学现象与某个测定指标的变化无关，而是与其它指标有关，例如H₂O₂含量下降，既可能是合成酶活性下降了，也可能是分解酶活性上升了，甚至合成酶活性下降的同时分解酶活性也上升，即使是降解酶活性上升，也可能出现CAT、POD和GPX活性都升高，或者至少其中某个或者两个升高，其它不变，甚至个别降低。
3.2 能否得出可靠、明确的研究结论
       如果测定数据本身没有问题，那么根据现有测定结果，能否得出可靠、明确的研究结论，就主要取决于测定指标的选择是否合理，尤其是有没有集中选择该代谢已知的可测定的全部指标！
       选择某个代谢的已知的可测定的全部指标，不同测定指标的测定结果就可以相互验证和相互配合，从而得出明确、可靠的研究结论：所研究的生物学现象与某个代谢相关，即主要由哪种物质含量变化引起，而且该物质含量的变化是由哪个或者哪几个酶活性变化调控的。
       如果漏测，则不能得出可靠、明确的研究结论。如果多测一些其它代谢的指标，则这些指标的测定结果对于得出可靠、明确的研究结论没有帮助，至少浪费。
3.3 生化测定数据能否支撑起一篇高水平的研究论文
       一篇高水平的研究论文，不仅需要有可靠、明确的研究结论，而且也需要足够的内容，尤其是测定数据！
       除了上述要集中选择某个代谢已知的可测定的全部指标外，还需要反映代谢的变化过程。一般而言，测定指标要5个以上，取样时间点也要5个左右。只有这样，才能有足够的内容支撑起一篇高水平的研究论文。
       以上是我个人的一些粗浅看法，只能算抛砖引玉。不当之处，欢迎大家批评指正，希望对生命科学研究者能够有所启发。
       祝大家研究顺利，取得更多、更大研究成果，导师优质结题，研究生顺利毕业！